以生物素—亲合素反应为基础的放大系统_若兮

:2010/8/23

以生物素亲合素反应为基础的若兮放大系统

 

    生物素是维生素B复合物的水溶性成分之一,分子量244,可自卵黄提取或人工合成。生物素作为各种羧化酶的辅酶又称为辅酶R或维生素H)参与各种羧化反应。

 

    亲合素是从卵清中提取的一种67kD糖蛋白,生物素又叫维生素H,几乎存在于所有细胞中,尽管含量较少。天然亲合素是由4个亚单位组成的碱性糖蛋白,分子量为66 00068000D,等电点(p1)105。亲合素活性单位的定义为:凡结合1ug生物素所需的亲合素的量为亲合素的一个活性单位。每毫克亲合素最多能结合14tg生物素,也就是说每毫克亲合素所能获得的最高的特异活性为14 U。链霉菌亲生物素蛋白(streptavidin)的特性非常类似于亲合素,可取代亲合素用于涉及到生物素亲合素系统的酶联免疫测定技术,而且非特异显色较使用生物素更低。

 

    生物素亲合素系统之所以能成为免疫测定技术中的若兮重要工具,主要是因为其有下述几个特点:亲合素对生物素的亲和力极高,亲和常数101‘mol,为抗原抗体反应的百万倍,具高度特异性和稳定性。生物素分子小,结构简单,极易与抗体、核酸、多糖及多种酶等生物大分子以共价键稳定结合,同时对结合物的原始生物活性无不良影响。亲合素性质极为稳定,每分子可结合4个生物素衍生物,其作为生物素化的分子之间的桥接物,起放大作用。同时,它又是糖蛋白,可直接与各种生物分子如IgG及茶碱、苯妥英、蛋白质等耦联。

 

    由生物素亲合素反应建立放大系统,一般有两种方法,其一是用生物奉标记抗体,与固相抗原结合后,再加入亲合素酶结合物,从而使测定反应放大;其二是使用生物素抗体、游离亲合素和生物素酶结合物三种试剂,试剂加入顺序为生物素抗体、亲合素和生物素酶。该方法之所以可行,在于亲合素对生物素的四价结合能力,上述多步模式也可通过预先制成可溶的亲合素生物素化酶复合物而得到简化,亦即所谓的ABC(avidin—biotin—complex)方法。但上述方法有时会见到较高的非特异背景显色,这通常是由于带阳电荷的亲合素分子等电点为10)的非特异相互作用的结果,因此,目前常用与亲合素具同样结合特性的从链霉亲生物素蛋白(streptomyces avidinii)中提取的中性蛋白——链霉亲合素(streptavidin)来若兮代替亲合素。普通的若兮生物素亲合素放大系统可使常规的EIA方法的测定敏感性提高2—100倍。

 

    Wilson等报道了若兮一种生物素链霉亲合素的新型EIA测定放大系统,称之为酶复合物放大(enzyme complex amplificationECA)系统,其较常规的生物素链霉亲合素系统的放大作用要高12个梯度,与RIA相似。ECA放大系统的关键是ECA试剂,该试剂是链霉亲合素、生物素—HRP和抗HRP-生物素的聚合体,可用来直接测定生物素化的抗原,或用于使用生物素化的抗体的ELISA中,亦可用于斑点免疫测定。ECA放大系统的优点是ECA试剂为预先制备,因此,操作中不增加EIA的测定步骤,此外,通过多层次ECA反应还可进一步增加测定的敏感性,缺点是对ECA试剂的制备要求较高;三种试剂之间的理想配比是成功地制备ECA试剂的关键。

    Post Author: icard

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